细胞自噬与非酒精性脂肪性肝病

导言北京时间10月3日揭晓年度诺贝尔生理学与医学奖，获得者为日本科学家大隅良典，奖励他在“细胞自噬机制方面的发现”。细胞自噬，这一概念最早出现于上世纪年代，其作用机制非常明确，那就是“自我吞噬”，是人类细胞的一个重要机制，能消灭入侵的细菌和病毒，还影响着胚胎发育和细胞变异。那么，自噬在NAFLD发生发展中发挥着怎样的作用呢？细胞自噬（autophagy）是细胞对代谢应激和环境变化的一种适应性反应，是溶酶体降解细胞内成分的重要通路，当营养缺乏时降解胞内细胞器和蛋白质，并循环利用，维持能量平衡。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指患者无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性、肝小叶内炎症和轻度纤维化为病理特征，排除了其他肝病的一组临床综合征,其病理类型包括单纯性非酒精性脂肪肝(nonalcoholicsimplefattyliver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)、肝纤维化及肝硬化，甚至可发展为肝癌。NAFLD的发病机制复杂，现在多认同DAY等提出的“二次打击”学说，即第一次打击为高胰岛素血症和胰岛素抵抗（Insulinresistance,IR）引起单纯肝细胞脂肪变性；第二次打击为氧化应激和脂质过氧化、炎性细胞因子释放、线粒体功能障碍等因素诱导肝脏炎性反应、肝细胞变性坏死和肝纤维化、肝硬化的发生。细胞自噬可通过多种途径调节脂质代谢、胰岛素抵抗、氧化应激、肝细胞损伤等，对自噬在NAFLD发生发展中作用的了解有助于深入研究NAFLD的发病机制、寻找有效的治疗方法。1.细胞自噬细胞自噬（autophagy）是由Ashford和Porter在年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是一种基本的细胞应激调控机制，细胞通过自噬溶酶体途径，将细胞质内的成分包括受损的细胞器、未折叠的蛋白质、病原体等降解或去除，为细胞的重建、再生与修复提供必须原料，实现细胞的再循环和再利用。根据降解物进入溶酶体方式的不同，细胞自噬大体分为3类，即微自噬（microautophagy）、分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy,CMA）和巨自噬（macroautophagy），其中巨自噬是最经典而且研究最透彻的一种自噬方式，所以通常将巨自噬简称为自噬。细胞自噬是一个多步骤的动态过程，包括诱导、成核、延伸、自噬体形成、自噬溶酶体形成5个阶段。在细胞自噬中，吞噬泡和自噬体的形成需要38种不同自噬相关蛋白（autophagy-relatedprotein，Atg），Atg是生物体由酵母到哺乳动物进化过程中保留下来的生物因子，主要参与自噬体膜的形成。在起始阶段，细胞自噬由ULK1-Atg13-FIP复合体和Beclin1-Vps34-Vps15-Atg14复合体控制。当饥饿或者营养供应不足时，三种不同的分子途径可以诱导细胞自噬的产生：1.体内低胰岛素水平抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3Ks)信号通路，降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）活性，激活ULK1（theUnc-51-likekinase1）/Vps34（vacuolarproteinsorting34）形成复合体，诱导细胞自噬发生；2.当细胞氧化应激、能量不足时，AMP/ATP比值升高，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）感受到AMP水平的变化，AMPK激活，抑制mToR活化，诱导细胞自噬；3.在饥饿状态下，c-Jun氨基端激酶1（c-JunN-terminalkinase，JNK1）可诱导B细胞淋巴瘤-2基因（B-celllymphoma2,Bcl-2）磷酸化，促使Beclin1与III型PI3K及Vps34结合形成复合体，促进自噬泡的形成[9]。除此之外，自噬体膜延伸并降解底物涉及到两个重要的泛素化共轭路径：Atgl2结合过程和LC3（Microtubule-associatedproteinlightchain3，Atg8的同源基因）修饰过程，Atg7是这两个过程接合的必要中介蛋白，是自噬研究的重要指标。同样，Atg9在自噬体膜形成中也具有重要作用，饥饿状态下，缺乏Atg9将不能诱导自噬体形成，AMPK-ULK1信号通路活化可以促使Atg9的表达，说明Atg9是自噬形成过程中的一个营养敏感调节器。1.1细胞自噬与脂代谢及胰岛素抵抗非酒精性脂肪性肝病的典型病理表现为脂肪变性，以甘油三酯（triglyceride,TG）和胆固醇在脂滴中过度积累为主要特征。脂肪组织通过调节葡萄糖的运输、脂肪的储存、脂肪因子的分泌，在控制脂肪和葡萄糖的代谢中发挥重要作用。当体内脂质适量增加或营养不足时，肝细胞自噬降解脂滴，分解生成游离脂肪酸（FreeFattyAcids,FFAs）和ATP为机体提供能量；相反的，当长期高脂饮食所诱发体内脂质大量堆积，将抑制肝细胞的自噬作用。在肝细胞内自噬降解脂肪小滴的途径被称作“噬脂”(lipophagy)。Singh等研究发现：在初始阶段，细胞自噬通过调节脂质分解抑制脂肪蓄积并阻止细胞凋亡而保护肝细胞。研究表明，在ob/ob小鼠模型中肝细胞通过特异性高表达Atg7诱导细胞自噬，改善代谢水平，大大减少脂肪变性；在培养肝细胞时加入自噬抑制剂抑制Atg5的表达，细胞TG水平升高，造成脂质超负荷。同时，减少肝细胞线粒体内脂肪酸β氧化，可减少FFAs的堆积，对维持肝脏能量平衡具有重要意义。FOXO（forkheadbox-con-tainingprotein，Osubfamily）转录因子是一类关键的自噬调控因子，以FOXO1、FOXO3的作用最为广泛。FOXO转录因子缺乏与脂肪变性、血脂异常密切相关，敲除FOXO1/FOXO3/FOXO4（LTKO）的小鼠表现为脂肪变性和高甘油三酯血症。转录因子EB（thetranscriptionfactorEB,TFEB）基因是自噬的调节因子，在脂质分化、代谢过程中具有重要作用。当敲除Atg14或者TFEB时肝脏内TG增加，而TFEB的过表达不能改善由自噬缺陷所导致的脂肪变性，表明TFEB作用对自噬机制有依赖性。胰岛素抵抗是机体对胰岛素生理作用的反应性降低，具体表现为外周组织对胰岛素敏感性下降以及对葡萄糖的利用障碍，是NAFLD的独立危险因素。胰岛素受体信号主要包括PI3K-Akt-mTOR和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)两条途径。IR可促使更多的FFAs向肝脏运输，出现代偿性高胰岛素血症，导致血脂紊乱，是脂肪变性发生发展的关键。研究显示，敲除瘦弱小鼠的自噬基因将诱导严重的胰岛素抵抗，而肥胖小鼠体内Atg7的过表达可改善胰岛素敏感性和糖耐量，降低内质网应激，减少肝糖原合成，减少脂肪变性。Yang等证实高胰岛素血症、高脂饮食喂养和ob/ob小鼠体内肝细胞自噬作用减弱，表现为LC3-Ⅱ大量减少、p62水平增高、自噬小体数量减少。此外，IR也可调节细胞因子的释放，促使肿瘤坏死因子α（Tumornecrosisfactor,TNF-α）等炎症因子的过表达，可进一步介导代谢、免疫功能紊乱及线粒体氧化应激，促进脂肪变的肝脏发生炎症、坏死和纤维化。1.2细胞自噬与肝细胞损伤非酒精性脂肪性肝炎以脂肪变性、肝细胞损伤、炎症反应和纤维化为主要特征，虽然细胞损伤的机制目前仍不清楚，但氧化应激和炎性细胞因子释放是其中主要的病生理机制。目前已证实细胞自噬能调节细胞死亡通路，包括氧化剂和TNF，也能调节脂肪变性诱导的肝细胞损伤。TNF可促使JNK磷酸化，同时激活核因子-κB（nuclearfactor-kappaB,NF-κB），诱导抗凋亡基因的表达。在一定的限制内，细胞自噬可以通过降解细胞内受损的线粒体、内质网等细胞器以维持ATP水平，应对氧化应激。但在病理状态下，氧化应激将诱发过度自噬，造成细胞凋亡以及核和线粒体DNA损伤，导致肝脂肪变性、炎症和纤维化。目前有研究发现，线粒体在NAFLD肝细胞损伤中起着关键的作用。细胞色素C的释放和Bcl-2家族通过与线粒体的相互作用，导致线粒体的功能障碍，使细胞供能不足，最终引起细胞的死亡。然而，氧化应激并不完全通过影响线粒体功能而导致细胞损伤，也可过度激活上游的JNK通路诱导细胞损伤。JNK是肝细胞损伤的调节器，在肝脏非实质细胞内，如Kupffer细胞、肝星状细胞等，参与炎症反应及纤维化。活化的JNK可以增加ROS，也可被招募于线粒体外膜上，诱导细胞损伤。此外，CMA在肝细胞对抗氧化应激中也发挥重要作用，敲除CMA受体溶酶体相关膜蛋白2A（Lysosome-associatedmembraneproteintype2A,LAMP-2A）将诱导肝细胞损伤。1.3细胞自噬与免疫最近的研究表明，细胞自噬已经成为先天免疫反应的重要调节机制，尤其是能够影响病原体识别受体，如Toll样受体（Toll-likereceptors，TLR）。在肝脏中Toll配体与NAFLD的发病机制（包括饱和脂肪酸、脂多糖、内毒素等）有关。TLR是一个模式识别受体家族，它们主要表达于抗原提呈细胞及一些上皮细胞上，为1型跨膜蛋白，胞外区具有富含亮氨酸的重复序列，能够特异识别病原微生物进化中保守的结构即病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularptems，PAMP)，可引发促炎基因的表达。研究表明在炎症初期，炎症小体可通过促进白介素1（interleukin1,IL-1）、IL-8的活化来维持平衡；另一方面，缺乏炎症小体，肠道菌群失调，TLR4、TLR9将被运至肝脏，造成脂肪变加重，产生TNF-α而加重NASH，从而促进NAFLD的发展。有研究表明，用脂多糖可诱导人和小鼠巨噬细胞发生自噬，并能增加Kupffer细胞中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达。同时，饱和脂肪酸通过活化TLR4，能够增加其他炎症小体的表达，增加肝细胞对IL-1β的敏感性，从而加重肝细胞的炎症反应。细胞自噬可通过将凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingCARD,ACS）泛素化及募集p62和LC3来降解炎症小体，从而起到直接抑制作用；其间接抑制作用则主要为减少ROS及氧化的线粒体DNA等炎症小体活化信号的释放。Atg16L1可参与自噬体形成，抑制NOD样受体蛋白质3（TheNOD-likereceptorprotein3,NLRP3）炎症小体的激活和IL-1β的分泌。Saitoh等通过对自噬功能缺陷Atg16L1-/-小鼠的研究证实，细胞自噬作用能直接或间接抑制TLR4信号介导的炎症小体活化。1.4细胞自噬与肝纤维化、肝癌肝纤维化是在持续性的肝实质细胞损伤和（或）炎症情况下，富含Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）合成与降解失衡。肝星状细胞（hepaticstell-atecell，HSC）的持续激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节。目前已经证实，TGF-β信号通路的活化、血小板源性生长因子（plateletderivedgrowthfactor,PDGF）、其他生长因子及氧化应激可诱导HSC的激活。研究表明，细胞自噬可为HSC的活化提供能量，促进HSC的活化，从而促进肝纤维化。细胞自噬在肝细胞癌发生与发展中具有双向调节作用，可以防止和促进肿瘤的发展。在正常细胞中，细胞自噬通过移除受损的细胞器和p62/SQSTM1等特定的蛋白质来预防肿瘤形成；而肿瘤形成后，细胞自噬又促进肿瘤的生长，为满足肿瘤细胞增殖的代谢需求，以氨基酸、游离脂肪酸、葡萄糖等形式为其提供营养支持。在肝脏中，敲除自噬基因Beclin1与原发性肝细胞癌发生、发展有密切联系。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同系物,也是哺乳动物参与细胞自噬的特异性基因，具有抑制肝癌细胞增殖、浸润、转移和血管形成的作用，并且能与多种分子相互作用，形成不同复合体而发挥作用。有研究发现ROS可以通过自噬相关蛋白Beclin1依赖性方式诱导自噬性细胞死亡，同样具有抑瘤作用。此外，mTOR途径及其上游通路PI3K、AKT抑制剂在肿瘤防治中也具有抑癌作用。当敲除Atg5后，只诱发肝脏相关癌，而其他组织不受影响，说明肝细胞对自噬的肿瘤抑制作用有依赖性。2.细胞自噬与药物作用靶点研究由于非酒精性脂肪性肝病目前没有明确的治疗药物，细胞自噬可作为治疗NAFLD的重要研究靶点。可以增加细胞自噬水平的可能方向包括：改善胰岛素敏感性、减少肝细胞脂质沉积、减轻细胞因子及氧化剂造成的细胞损伤、抑制巨噬细胞的激活减轻炎症反应等。一些药物通过上述机制对NAFLD有潜在的治疗作用。雷帕霉素可以诱导自噬，减少肝毒性和脂肪变性（TG水平)，并改善胰岛素敏感性。卡马西平，一种常用的解痉药，已被证实可用于对α抗胰蛋白酶缺乏小鼠的治疗，能降低肝细胞中突变α1抗胰蛋白酶的水平，并能减轻肝纤维化程度。最近的一项研究显示，用自噬增强剂雷帕霉素（mTOR-C1抑制剂）或卡马西平（mTOR独立诱导剂）治疗高脂饮食小鼠12周，可降低肝脏和血液中TG水平、降低血糖和减少肝损伤，并显著降低血清胰岛素水平。白藜芦醇，被认为具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病及抗衰老等功效。目前已经证实，在NAFLD动物模型中，白藜芦醇可以通过抑制TNF-α和抗氧化作用、活化AMPK信号通路、诱导SIRT1和SIRT4的表达、抑制NF-κB的活性等多种途径调节细胞自噬水平，改善胰岛素抵抗，减轻炎症反应及肝细胞损伤。二甲双胍是一种口服降糖药物，可以改善胰岛素抵抗，激活AMP，促使AMPK磷酸化，进而使Tsc1/2磷酸化，抑制mTOR信号通路，增加细胞自噬减少肝脏损伤。虽然这些药物已被证实能通过某种作用机制起到治疗NAFLD的目的，还需要大量的研究进一步证实细胞自噬调节剂对NAFLD的疗效与机制。3.小结细胞自噬是一种重要的生理过程，参与多种生理、病理机制，维持体内重要细胞的功能。本文综述了在NAFLD发生、发展过程中，细胞自噬调节脂质代谢、胰岛素抵抗、免疫细胞及肝星状细胞等的可能机制；阐述了一些药物对自噬的调节作用，表明增强细胞自噬作用可能是治疗NAFLD的一种有效方法，旨为NAFLD发病机制的研究及临床治疗提供新思路。当然，细胞自噬与NAFLD的关系，以及治疗药物的选择与应用，还需要进一步探讨和临床试验。

全文参见：中华肝脏病杂志,,24(8):-.

图片来源：网络。

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